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　　应用方向1、LIBRA-Seq加速单抗筛选

　　1、引言

　　无论大分子还是小分子药物，药物的筛选都是一项浩大的工程。节前在2020杭州制药大会上了解到，一般这个过程会持续半年到两年的时间。最理想化的情况是利用现有的庞大抗体库，一次性对多种抗原进行筛选，同时还能获取配对的抗体的重链轻链信息。这样我们才能够鉴定针对不用毒株的中和抗体。不少企业还在使用384孔板进行筛选，通量很低，速度也不快。目前了解到筛选最多最快的是成都先导(https://www.hitgen.com/)，利用DNA编码化合物库进行药物筛选，通常是小分子药物。一个库能达到上亿种化合物，周期3-6个月。

　　而LIBRA-Seq(linking B cell receptor to antigen specificity through sequencing)以10X Chromium为平台，开发了一种高通量的单抗筛选方法。顾名思义，它是通过测序将B细胞受体与抗原特异性联系起来。

　　2、技术原理

　　LIBRA-Seq使用了抗原四聚体作为抗原，它们同时具有寡核苷酸条形码和荧光探针两种标记。将B细胞与标记的抗原混合后，使用流式的方法对抗原特异性B细胞进行分类。利用10X单细胞测序，既找出抗原对应的条形码，又找出重链和轻链序列。

　　3、三大优势

　　(1)一周内可筛选更多抗原;

　　(2)可以获得单细胞分辨率的抗原特异性图谱;

　　(3)可以将重链轻链序列与抗原特异性关联起来。

　　4、文章分享

　　High-Throughput Mapping of B Cell Receptor ices to Antigen Specificity (Cell 2019)

　　此文章是最初LIBRA-Seq方法学建立的文章，2019年12月发表再Cell上。

　　实验的细胞供体是名HIV感染者，他体内含有一种抗体株VRC38，能够产生HIV中和抗体。但是VRC38谱系本身无法解释完整的血清中和能力，因此可能还存在其他的抗体谱系。文章因此主要确认了两件事：1、利用LIBRA-Seq能够从VRC38谱系中回收抗原特异性B细胞;2、存在新的中和抗体，并且这些抗体可以中和VRC38不能中和的病毒。

　　筛选文库由9种DNA编码的抗原组成，待筛选细胞是PBMC细胞。获得1500个细胞的数据后，作者mapping还原了细胞的重链轻链序列。

　　5种HIV-1抗原(KNH1144、BG505、ZM197、ZM106.9、B41)，4种流感抗原(H1 A/New Caledonia/20/99、H1 A/Michigan/45/2015、H5 Indonesia/5/2005、H7 Anhui/1/2013)

　　PBMC供体是N90。

　　下图系统发育树显示了B细胞的成熟历史以及对于特定抗原的亲和力。上方红色框选中的成员更接近树根，具有较为单一的中和能力。而下方红框中选中的成员原理树根，具有更多样化的中和能力。

　　图中以黑色显示VRC38谱系成员，红色显示LIBRA-Seq新发现的成员。每一行代表一种抗体，对于每种抗体用热图显示了HIV抗原的LIBRA-Seq得分，得分根据相应抗原条形码的UMI数目进行计算。

　　作者还用Cell Ranger VDJ组装程序发现了一些其他突变型抗体。即便发现的抗体相对胚系基因序列，大约有30%-40%的变异，但还是能够通过SPR验证。研究因此还确定了一组新抗体，能够更好地解释血清中和谱，对已有的VRC-1抗体中和谱进行补充。

　　中和力强弱用IC50表示，数值由低到高，表示中和力逐渐下降，颜色由红到绿。测定浓度下没有亲和力的由白色表示。

　　至此，作者不仅鉴定到了现有的VRC01抗体，还筛选出了VRC01家族中新的HIV广泛中和抗体。

　　作者认为，抗体能够识别不同的抗原。实验结果也确实如此，除HIV抗原外，作者还在同一个样本中分离出了流感抗原。并对比了ELISA测量值和LIBRA-Seq得分，可以看到二者之间几乎完美对应。

　　来自供体NIAID45的LIBRA-Seq鉴定的抗体序列特征和抗原特异性。

　　一致度由核酸序列计算，CDRH3和CDRL3长度由氨基酸序列计算。

　　每个抗原的得分高低由热图展示，得分再-2和2之间。-2表示为黄色，0表示为白色，2表示为紫色。

　　ELISA亲和力结果也用热图展示，其中AUC为0显示为黄色，50%最大值显示为白色，最大值显示为紫色。

　　作者总结：他们测试的每种不同HIV抗原的LIBRA-Seq得分都很高，其中有124个细胞同时对4种以上的抗原有很高的得分。

　　总而言之，LIBRA-Seq可以使用大型抗原panel对来自HIV感染者的单个B细胞进行高通量高度多重筛选。可以通过单细胞分辨率的抗原特异性，鉴定出来自该供体的数百种抗原特异性单克隆抗体。

　　5、与现有筛选方法的对比

　　以往基于杂交瘤和噬菌体展示的工作流程，仅与单个靶标兼容。一般花费数月可以找出10-1000个克隆，再经过大量验证和生产准备工作，往往又会花费数月时间。

　　而基于10X平台的LIBRA-Seq筛选方法，能够一次性筛选数以万计的T细胞和B细胞受体序列，同时获取抗原特异性信息。也可以获取基因表达数据或者细胞表面蛋白表型。最后获得的抗体可以由ELISA、SPR或者其他结构测定方法进行验证。