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　　【研究背景及意义】

　　骨骼肌是复杂的异质性组织，约占体重的40%，其机械功能和代谢作用对动物健康至关重要。骨骼肌通过成肌祖细胞和成肌细胞的状态来启动成肌。肌肉的发育和再生完全取决于肌肉生成，其损伤与各种肌肉功能障碍有关，包括肌肉萎缩，肌肉减少症和肌肉营养不良。而过量的脂质蓄积会损害骨骼肌蛋白质合成，不仅导致肌肉收缩功能下降，还会导致胰岛素耐受，肥胖症和糖尿病。因此，保持骨骼肌功能正常对增强肌发生和抑制脂质沉积具有重要意义。

　　几十年来，遗传选择导致了瘦型猪的出现，从而导致了肌肉发育在质量和速度上的能力增强，这形成了非常特殊的表型差异，可用于探索肌肉形成、脂肪形成以及肌肉发育之间如何达到平衡。

　　【研究对象】

　　新生纯种莱芜猪(Laiwu下文后缀-L的均表示胖型猪)和约克郡3日龄仔猪(Yorkshire下文后缀-Y的均表示瘦型猪)

　　【研究方法】

　　单细胞RNA测序：10× genomics 3’ Chromium v2.0平台，Illumina HiSeq 2500测序平台;蛋白质组学分析：总蛋白提取，TMT标记和LC-MS / MS分析;flow cytometry 检测细胞离子浓度

　　【研究结果】

　　1、肌肉衍生细胞的分化潜能

　　(图1)

　　将消化得到的肌肉单细胞进行原代细胞培养并分离，培养2h以内的为Adi细胞系，培养2-72h的分离成Myo细胞系，比较不同细胞系的分化潜能。图1AB表示在Adi细胞系中基因表达差异不明显，而在Myo细胞系中瘦型猪成肌相关基因表达量明显高于胖型猪。成脂诱导后，Adi细胞系分化为圆形的成熟脂肪细胞，积累了大量脂质，且在两种猪之间无差异，图1CE)。成肌诱导后，Myo-Y的分化指数和融合指数显着高于Myo-L(图1DF)。

　　2、Myo细胞系的图谱分析和轨迹分析

　　单细胞RNA测序结果表明，在两种猪中得到了相同种类数的细胞(表1，图3A)，但瘦型猪中Myo细胞系的比例更高(图3A)，且高度表达成肌特异性基因(图3B)，如间充质细胞(CD29 和CD44)、卫星细胞(CD82, NCAM1, and Pax7)和肌细胞(ACTA1, TNNT1, 和 TPM1)。

　　(表1)

　　(图3)

　　为了促进对两种猪的Myo细胞系中细胞异质性的理解，确定出了五个不同的细胞亚群(图2B，图4A)。拟时序分析得出5种细胞亚群之间的发育轨迹(图4C)，卫星干细胞(group2)来源于肌肉祖细胞(group1)，有两种不同发育轨迹，第一种发育成卫星细胞(group3，cell Fate A)，第二种发育成成肌细胞(group4)，随后再发育成肌细胞(group5， cell Fate B)。代表从祖细胞到肌细胞的肌源性分化的不同状态的标记基因的表达在Myo细胞系的五个亚群之间明显不同(图4D)。

　　(图2)

　　(图4)

　　3、Myo细胞系蛋白质组的定量图谱

　　使用TMT标记对从肥胖和瘦型猪(n = 3)分离的肌肉肌细胞进行蛋白质组学分析(图2A)，在Myo细胞系中鉴定并定量了6199种蛋白质。肥胖和瘦型猪之间DEPs(蛋白质)的相对表达通过热图可视化(图2C)。上调的10种DEPs中，4种与细胞增值与分化有关，2种是肌蛋白组成成分，2种与胞内钙离子浓度紧密相关，另2种与离心跨膜运输和脂质合成有关。下调的10种DEPs中，4种涉及肌肉发育与再生，5种与人类疾病紧密相关，另1种是核内膜蛋白，涉及神经发育(表2)。

　　(表2)

　　4、GO和KEGG分析进行DEPs的生物信息学探索

　　总共181个DEPs用于GO富集分析，并且显着富集了24个细胞成分，32个分子功能和69个生物学过程。根据其分子功能，DEPs可以大致分为三类，包括肌肉成分，转运蛋白和受体以及离子稳态。肥胖和瘦型猪的Myo细胞系具有不同的碳水化合物和脂质代谢模式，因为与碳水化合物代谢有关的13个生物过程和与脂质代谢有关的11个生物过程都富含DEPs。在本研究中，我们主要关注属于肌肉结构，凋亡，细胞增殖和分化，离子稳态和MAPK信号通路的生物过程。五个KEGG信号通路显着富集了181个DEPs，如GABAergic突触，甘油脂代谢，溶酶体，磷脂酰肌醇信号传导系统以及缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸降解。

　　根据以上生物信息学分析，DEPs的功能主要分为五类，包括肌肉发育，离子稳态，细胞增殖和分化以及细胞凋亡和基因表达。图5显示了五类之间典型的DEPs交互关系。

　　(图5)

　　5、Myo-L和Myo-Y之间不同的细胞离子调节

　　热图展示了参与调节细胞离子浓度的DEPs的表达(图7A)。除下调的MT-CO1，SH3RF1和SLC38A5外，它们中的大多数与Myo-L相比在Myo-Y中上调，包括ANXA5，ATP6V1C1，CAMK2N2，CKB，EHD3，IREB2，S100A16，SLC4A4，SLC4A8，TMEM63 和TNNT2。通过流式细胞仪检测细胞离子浓度，包括细胞质Ca2+，内质网Ca2+和细胞质Cl-(图7B-D)。与胖型猪相比，从瘦型猪分离出的Myo细胞系中，细胞质和内质网中处于静止状态的Ca2+浓度均显着降低(图7E，F)，而细胞质Cl-浓度没有差异(图7G)。在Myo细胞亚群之间，位于内质网膜(ATP2A1 和ATP2A2)和细胞膜(ATP2B1 和ATP2B4)的Ca2+转运蛋白的表达明显不同(图7H)。

　　(图6)

　　【总结】

　　本文用轨迹分析证明，肌肉祖细胞分化为卫星干细胞，随后分化为卫星细胞和成肌细胞，后者在谱系进展中进一步分化为肌细胞。由于对瘦型猪产量进行了严格的遗传选择，瘦型猪相对于胖型猪的骨骼肌特征在于肌肉生成增强而不是脂肪抑制，瘦型猪的肌肉衍生细胞更接近肌肉祖细胞的原始发育阶段。Myo细胞系分化潜能与细胞内离子稳态Ca2 +的独特调节密切相关。低浓度的细胞Ca2 +有利于Myo-lineage细胞保持强大的分化潜能。

　　本文了解了肌肉生成的规律，具有改善肌肉发育和再生的价值，并为治疗肌肉相关疾病提供了新的视角。